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第一弹  /  NK细胞培养血液标本处理相关问题

 1血液采集抗凝剂如何选择

 

根据文献表明,抗凝剂不仅影响NK细胞的增殖,还影响NK细胞的杀伤功能,其结果显示,细胞保存液组和肝素钠组对NK细胞的体外扩增影响小,EDTA抗凝剂不利于单核细胞的增殖培养。由于抗凝剂是外源物质,应选择对细胞体外扩增培养影响小的抗凝剂,如细胞保存液和肝素钠。

肝素钠具有较好的抗凝效果,主要通过抑制凝血活酶与凝血酶的形成,同时激活纤溶酶而发挥抗凝作用,对细胞没有损伤,其他抗凝剂作用于细胞表面的Ca2+离子,可能会对细胞产生损伤,不利于细胞的扩增培养。用保存液抗凝的采血袋,尽量现采现分,减少影响,影响与时间成正比。

2、外周血标本采集后的处理时间

 

采集的血液最佳处理时间为2个小时,最长不超过4个小时。采血时间过长对分离PBMC的得率及后续细胞的诱导培养均有影响。

 

 

 

 

3、外周血单个核细胞分离方案的选择

 

单个核细胞分离有两种方案,第一种为全血直接加分离液分离,第二种为先分离血浆后再加分离液分离。

NK细胞培养建议选用第一种方案,15~20ml的分离液加入20~25ml的外周血,把移液器降速调到低档,缓慢加入,离心为800g,20min,离心机升降速需缓升缓降(thermo为升3降2,国产离心机为升1降0),若血液时间超过2小时,离心时间调为30min。

第二种方案先分血浆再分离收集PBMC,分离血浆离心力如果太大,或者增加操作步骤等都可能会对细胞造成损伤,影响细胞增殖和表型。

4血液分离操作时注意事项有哪些

 

(1)血液加至淋巴分离液层时,电动移液器降速应调到最低,降低血液加入速度,避免血液层与分离液层混合;

(2)分离完毕时,尽量将白膜层、分离液层都吸取离心,保证单个核细胞的得率。

 

 

 

 

5、脐血分离方案的选择?

 

成人外周血中都是成熟的无核红细胞,脐血中有很多不成熟的有核红细胞,与单个核细胞密度相近,直接分离会出现在白膜层,所以需要把红细胞沉降。否则分离的CBMC红细胞过多,会影响后续细胞培养。

为了简单有效地分离脐带血CBMC,最大程度减少红细胞的干扰,并且保证分离的淋巴细胞生物活性。在分离脐血CBMC时,首先应使用样本预处理试剂,使样本中密度不一的大部分红细胞和幼红细胞加速沉降,其次使用样本高效分离液,使脐血中的各细胞形成有效的细胞分离层。

6高血脂血浆处理方法

 

高血脂血浆是指血浆上层有油脂、血浆呈浑浊白色,用于NK细胞培养会影响细胞的增殖和表型,应弃掉血浆,可使用血替或者AB血清替代,血替添加量相对血浆量减半,使用5%的添加量即可。

 

 

 

7血浆如何灭活灭活不彻底的影响

 

血浆需使用恒温自动加热仪彻底灭活,消灭补体的活性,温度设置为56℃灭活30min,静置到室温后1200g离心10min,去掉沉淀后再使用。

如果血浆灭活不彻底,在细胞培养前期,会导致贴壁的细胞增多,转瓶或转袋细胞吹打不下来,造成细胞损失,最终导致培养的细胞数量和流式表型没有达到预期效果,血浆没有彻底灭活还可能导致细胞黏连,使细胞死亡,最终导致细胞培养效果不好。

8细胞数量分离较少NK细胞如何诱导培养

 

单个核细胞分离数量少,需先保证NK培养的起始密度,外周血起始密度为1.3~1.5*106,脐血起始密度为2.0~2.5*106,再确定起始体系,补液体积按比例相应减少,前期补液时需添加5~10%血浆保证细胞增殖速度。

 

 

9细胞洗涤用DPBS还是生理盐水?

 

磷酸盐缓冲液是一种平衡盐溶液,主要用途是漂洗、稀释或作为基础溶液配置其他溶液,用途非常广泛,是细胞实验室必不可少的一种试剂。在清洗细胞时,有时会使用生理盐水,但其并不具备缓冲能力,而磷酸盐缓冲液除了NaCl外,还有Na2HPO4和KH2PO4成分,可以在温度、气体组成变化时缓冲,且pH值范围很广,以此保证正常的PH和渗透压,对细胞膜和离子通道有更好的保护作用,因此,生理盐水并不能代替磷酸盐缓冲液使用。

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