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利剑出鞘|脐血中PBMC的高效分离及NK细胞的高效培养

浏览: 发表时间:2022-03-21 16:58:09
CAR-NK
细胞治疗界冉冉升起的“新星”

NK细胞进入临床试验已有十几年时间,但扩增困难、诱导技术差异大、诱导效率低等因素影响,随着科学技术的发展,很多技术难题都将被攻克,有机构估测2021年全球NK细胞疗法市场销售额达到了3.5亿美元,预计2028年将达到10亿美元。

2021年11月11日,国家药品审评中心通过了一款由国健呈诺生物研发的针对“晚期上皮性卵巢癌治疗的靶向间皮素(Mesothelin,MSLN)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK)注射液”的临床试验申请。这是国内首例正式审批通过的“现货型”异体来源的CAR-NK产品。近日,Fate Therapeutics宣布,美国FDA已批准其“现成”的、iPSC衍生的CAR-NK候选产品FT536的研究性新药(IND)申请。随着CAR-NK产品的喜报频传,NK细胞也逐渐成为肿瘤免疫疗法的热门候选者。



UNK
脐血NK细胞
癌症免疫治疗的“现货”产品


NK细胞来源非常广泛,包括外周血、脐血、诱导多能干细胞(iPSC)和NK92等细胞系。在众多样本来源中,脐血作为现成的异源性资源,具有来源广泛且无伦理问题,其所含的幼稚免疫细胞不易引发移植物抗宿主病(GVHD),同时脐血中含有的NK前体细胞多于成人外周血等特点,成为治疗性NK细胞最有前途的无创性来源。

脐带血来源的NK细胞治疗多发性骨髓瘤的II期临床试验,结果显示,79%患者获得了完全缓解或很好的部分缓解,3年无进展生存率可达52%。另有研究表明,脐带血NK细胞具有较强的体内外抗肿瘤活性,可单独应用或联合贝伐单抗用于中晚期结直肠癌的治疗。除此之外,长期冷冻保存对脐带血NK细胞的扩增潜能和抗肿瘤活性都没有影响。这也使得脐带血NK成为推进NK细胞免疫治疗领域的一个可行细胞来源。


脐血NK细胞与外周血NK细胞有什么区别?
▶脐血NK的细胞毒性更低、归巢潜力更大



根据研究表明,与外周血NK细胞相比,脐血NK细胞表现出相似水平的CD56、天然细胞毒性受体NCRs(NKp46和NKp30)和NKG2D,但CD16、粘附分子(如CD2、CD11a、CD18、CD62L)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体KIRs、DNAM-1、NKG2C、CD57和CD8(与末端NK细胞成熟相关的受体)的表达较低,且抑制受体NKG2A的表达较高,表明脐血NK细胞比外周血NK细胞具有不成熟的表型,细胞毒性降低。此外,与外周血NK细胞相比,脐血NK细胞具有更高的骨髓归巢受体CXCR4的表达,这表明脐带血NK细胞可能具有更大的归巢骨髓的潜力。      




脐血NK细胞与外周血NK细胞有什么区别?

根据研究表明,脐血与成人外周血血液成分存在较大差异。首先,脐血中的白细胞数目明显高于与成人外周血,脐血里有核细胞数目更多,且富含干细胞等原始细胞成分,保证了脐血中有足够的PBMC进行诱导NK细胞。

其次,脐血中血红蛋白(HB)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)及平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)较成人外周血明显偏高,不仅如此,由于红细胞中的血红蛋白占90%,红细胞破裂会导致血红蛋白含量进一步增高,据文献显示,较高浓度的血红蛋白能抑制细胞增殖(如血管内皮细胞、骨髓瘤细胞等),因此,在分离脐血PBMC时,应考虑尽可能减少脐血中血红蛋白以及红细胞的影响。


最后,脐血中红细胞体积较大,含有较多的幼红细胞,根据血流变学测定实验显示,脐血血球压积较高,红细胞变形性较低而聚集性较高,使脐血呈高粘滞状态,红细胞沉降率显著降低,其大小不一,密度不同,很难与白细胞、血小板等分离并形成有效的细胞密度分离层。因此,如何减少脐血中红细胞的影响是脐血PBMC分离的最大难点。



如何高效分离脐血PBMC并减少红细胞的影响?


根据研究表明,直接用淋巴细胞分离液分离脐血PBMC的回收率仅有54.40±4.52%,分离率低且分离效果差,导致无法保证有足够的PBMC用于NK细胞的诱导培养。据文献显示,使用淋巴细胞分离管或采用不同降温速率均可提高PBMC的分离效果,但这些方法在分离成本、分离操作上存在一定的局限性。

为了简单有效地分离脐带血PBMC,最大程度减少红细胞的干扰,并且保证分离的淋巴细胞生物活性。在分离脐血PBMC时,首先应使用样本预处理试剂,使样本中密度不一的大部分红细胞和幼红细胞加速沉降,其次使用样本高效分离液,使脐血中的各细胞形成有效的细胞分离层。与此同时,为了保证PBMC的生物活性,应使用细胞高效处理试剂降低样本的高粘滞状态及去除干扰物质。




如何高效诱导扩增脐血NK细胞?


目前NK细胞体外诱导扩增的技术路线主要有两种,一种是将肿瘤细胞株用作滋养层细胞来培养细胞,虽然能够大量扩增NK细胞,但添加异体细胞作为滋养层细胞,尤其是K562癌细胞株,在临床应用上也存在重大风险与伦理问题。另一种则是采用纯因子细胞培养,纯因子细胞培养技术安全性高,但由于在培养过程中需要添加不同种类不同浓度的细胞因子或抗体,操作相对繁琐且成本也难以把控。因此,如何选择在体外诱导扩增脐血NK细胞的方案显得尤为重要。


为了获得大量高纯度的脐血NK细胞以满足临床输注的应用,在脐血NK细胞培养过程中,应注意以下几点:

1.在采集脐血样本阶段,应保使用正确适量的抗凝剂(如肝素钠抗凝剂),以保证样本的有效性。

2.在分离脐血PBMC时,应选择专用的脐血样本密度分离液,在保证脐血中PBMC的生物活性和数量充足的同时,尽量减少红细胞的残留。

3.NK细胞培养最佳起始接种细胞密度为2.0~2.5×106cells/ml。

4.优选高性能的脐血NK细胞培养试剂盒根据《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则(试行)》要求,应尽量选择符合ISO9001质量管理体系的生产用材料(如培养基、细胞因子、各种添加成分等),培养基及试剂盒应不含动物血清成分及异种蛋白成分。
我司推出的脐血NK细胞培养试剂盒配备独特的UNK-PLUS添加剂,含有成分明确的医用级人重组蛋白复合物,不仅增加细胞培养的营养物质,还可替代异体血浆的加入。试剂盒优选高品质细胞因子以确保NK细胞的高效诱导并收获高纯度的NK细胞。本试剂盒操作简单,全程无须额外添加营养物及因子等,满足冻存及新鲜48小时内脐血NK培养。



部分参考文献:


1.马金栋. 新生儿脐血细胞的免疫状态. 中华妇产科杂志.1998;11(10):682.

2.尹卫东,刘克芹,石万元,等.新生儿脐血细胞分类计数结果分析.张家口医学院学报,2003,20(3):44~45.

3.马虹,马云胜. 新生儿脐血与成人外周血细胞比较分析. 数理医药学杂志,2007,20(2):246.

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5.姜胜华,丁润生.脐带血血液流变学测定及其临床意义.交通医学,1999,13(1):21.

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10. Hoogstad-van Evert J,Bekkers R,Ottevanger N,et al. Intraperitoneal infusion of ex vivo-cultured allogeneic NK cells in recurrent ovarian carcinoma patients ( a phase I study). Medicine ( Baltimore),2019,98(5):e14290.


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