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破冰行动|免疫细胞的冻存复苏及高效诱导培养

浏览: 发表时间:2022-04-24 13:45:00


2022年开端,一场新冠“倒春寒”向我们席卷而来,病毒的横行肆虐让上海、长春等城市都按下了暂停键,进入停摆状态。疫情发展至今,我们与新冠病毒的较量很可能是一场持久战。我们该如何面对新冠病毒呢?上海华山医院感染科主任张文宏教授给出了答案:“最有效的药物是人的免疫力。”而免疫细胞,则是抵抗病毒的重要角色。




免疫细胞俗称白细胞,包括先天性淋巴细胞、各种吞噬细胞等和能识别抗原、产生特异性免疫应答的淋巴细胞等,如T细胞、NK细胞、DC细胞等,具有查找、杀灭、清除衰老细胞、癌细胞、变异细胞等功能。GONZALEZ-MELJEM等研究人员认为,机体衰老的同时伴随着细胞衰老,衰老的细胞可以通过旁分泌作用促进肿瘤细胞增殖。随着年龄的增加,免疫细胞不仅大幅衰老,且多样性逐渐减少,40岁后,更是加剧了衰老和多样性减少的速度,这表明,人体内免疫细胞的数量和质量会随着年龄的增长而逐渐变差,患病患癌风险也会因此大大增加。



近年来,基于免疫细胞而研发的CAR-T药物的上市和对CAR-NK细胞的进一步设计研究表明免疫细胞在肿瘤治疗中具有重要作用。细胞技术的发展和新冠病毒的肆虐,使得人们意识到免疫细胞的重要,为了预防疾病,许多人选择在身体健康时,将自己最年轻、状态最佳的免疫细胞安全采集并超低温储存起来,在有抗衰防病之需时再回输体内来对抗疾病、延缓衰老、调理亚健康。




免疫细胞冻存,即从人体采集血液并分离出外周血单个核细胞(PBMC),利用超低温技术,将分离出的PBMC冻存于-196°C的液氮中进行长期保存。PBMC包括淋巴细胞和单核细胞,可通过诱导激活为不同的免疫细胞,如CIK细胞、NK细胞等。其中自然杀伤细胞(NK细胞),是机体重要的免疫细胞。近年来,以NK细胞为基础的癌症治疗研究呈指数级增长,目前已成为免疫治疗创新的主要领域。

研究表明,深低温能抑制细胞内酶的活性,使细胞代谢缓慢甚至停止,从而避免细胞遗传性状的改变。细胞储存在-196℃液氮中,理论上储存时间是无限的。Kleeberger等对PBMC进行12年深低温冻存研究后指出,PBMC冻存12年后仍可进行细胞免疫表型和抗病毒研究,细胞活性不低于90%;HOLUBOVA等研究表明,冻存复苏的NK细胞在IL-2激活后能表达NK细胞活化受体NKp44,NKG2D和CD25,并对血液肿瘤细胞系K562具有细胞毒性作用,冷冻保存的NK细胞仍具有较高的肿瘤杀伤活性。



PBMC总体是脆弱的,在冻存和溶解过程中的粗糙处理可破坏PBMC的功能,而且PBMC经过冷冻保存后,表面的超微结构以及酶冻存溶解后的构型可能发生一些变化,冻存PBMC复苏后,生物活性、生物及敏感度发生改变;受冻存试剂、冻存方法等因素影响,复苏后的细胞,虽然在形态上无明显差异,但在数量上会有较大损失,从而加大了诱导成为NK细胞的困难。基于NK细胞广阔的应用前景及大疫情时代背景,如何使冻存PBMC高效诱导培养NK细胞成为目前亟需解决的问题。

为了获得大量高纯度、高增殖、杀伤性强的NK细胞以满足临床研究和大健康产业的需求,对于冻存的NK细胞培养,应注意以下几点:


01.选择安全高效LaboBanker2 无血清细胞冻存液进行冻存


低温生物学家Mazur认为,直接冷冻时,细胞内外的水分会很快形成冰晶,从而引发细胞的一系列机械损伤,甚至导致细胞死亡,因此减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。LaboBanker2 无血清细胞冻存液与传统的细胞冻存液相比,无需配制,即取即用,适用于PBMC、干细胞、脐带血系等多种细胞的长期冻存。该冻存液使用安全稳定的高分子聚合物,无需程序降温,能使细胞在冻结前迅速失水,减少冰晶的形成,能够更好的保存细胞的生物性能,并且不含动物血清,成分明确,避免了外源物质的污染风险。



02.最佳冻存密度为5×105~1×107/ml。


研究表明,冻存细胞的密度也会影响冻存效果。过高的PBMC冻存密度会影响其细胞活性及细胞扩增倍数,过低的冻存密度则会因为增大冻存体积而大大提高冻存成本。


03.冻存PBMC的复苏

在使用冻存PBMC专用复苏液重悬细胞时,应使细胞密度为2.0~2.5×106cells/ml,并置于5%CO2、37℃培养环境中孵育60min,使细胞状态得以迅速恢复。



04.优选专用的冻存NK细胞培养试剂


目前使用的冷冻保护剂大多为渗透性保护剂DMSO,复苏后不易完全洗除,并且DMSO在常温下细胞毒副作用较大,能通过干扰细胞代谢、酶活性、细胞周期等影响细胞的生长和功能,复苏时易引起细胞凝集,导致NK细胞诱导难、数量少。还有研究表明,在细胞治疗中使用DMSO冷冻保存过的细胞可能会引起病人的临床副反应,如过敏、肠胃不适等。

我司推出的冻存NK细胞培养试剂配备独特的复苏液,该复苏液不含血浆,添加优质细胞因子及高分子聚合物,不仅能够有效中和冻存液中的DMSO及细胞碎片等有害成分,还可筛出损伤细胞以及有效预防高活力状态细胞的粘连,使细胞在60min即可恢复冻存前的生物活性。该复苏液不含动物血清及异质源蛋白,避免病毒、支原体、真菌等细胞污染以及血清批次差异的影响。能够维持细胞复苏过程中渗透压平衡并解决细胞复苏过程中细胞再结晶引起细胞损伤问题,提高复苏后的细胞活率,使细胞能够最大限度的被诱导活化并提高细胞扩增倍数。除此以外,该试剂盒所选用的高品质细胞因子均为医疗级人重组蛋白复合物,能够确保NK细胞的高效诱导并收获高纯度的NK细胞。本试剂盒操作简单,全程无须额外添加营养物及因子等。



随着再生医学和细胞治疗的发展,免疫细胞的储存,无论对临床还是科学实验都具有重要意义。贝索细胞将一直以“细胞科学,守护生命”为宗旨,致力于细胞产业的发展,持续为客户提供高质量的产品和优质的服务。

*如果您想了解更多产品信息,请联系贝索细胞市场经理。


部分参考文献:

1. 吴敬智,缪着,等.影响悬浮细胞冷冻保存活性的因素分析.中国医药生物技术.2020;15(5):512~517.

2. 王桂喜,董磊,李春红.不同冻存保护剂对外周血单个核细胞的影响.中国输血杂志,2010,23(5):384~386.

3. 邱佳裔,贾晓青,黄岗,等.细胞、组织冻存方法及应用的研究进展.中国生物制品学杂志,2017,30(5):546~550.

4. 林科佳,刘赴平,马冬磊,等.冻存密度对外周血单个核细胞冻存效果的影响.生物技术通报,2019,35(6):119~124.

5. 魏雪飞,许贤豪,等.免疫细胞的冷冻保存.中国神经免疫学和神经病学杂志.2003,10(1):39~40.

6. 睢晓洁,潘超,等.以氧化三甲胺作为细胞冻存保护剂的研究.中国科技论文,2017,12(12):1341~1345.

7. 李洁,刘斌,等.不同条件下细胞冻存效果比较.临床口腔医学杂志,2004,20(2):84~85.


*部分图片源于网络,侵删



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